今天给大家分享一篇赵远锦老师课题组的文章，文章内容主要讲述了赵老师的团队提出了一种新颖的分层反蛋白石多孔支架，该支架通过简单的微流体方法制成，用于促进3D细胞共培养技术。设计的支架是乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的组合概念构建的。这项工作表明，所得到的支架保证了细胞培养过程中营养物质的充足供应，从而实现了大体积细胞培养。此外，通过在支架中连续种植不同的细胞，可以开发一种内皮细胞包裹肝细胞的3D共培养系统，用于构建某些功能性组织。还证明了将所提出的支架用于共培养系统有助于肝细胞维持特异性体内功能，这些分层的反蛋白石支架为3D细胞培养甚至仿生组织的构建奠定了基础。
【背景分析】
三维(3D)细胞培养是一种有效的技术，可在培养过程中为细胞提供更接近其体内生存条件的微环境[1-5]。3D培养中的细胞可以通过紧密连接或间隙连接建立细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的连接，形成类似于细胞在体内生长的3D结构[6-9]。因此，3D细胞培养不仅可以保留体内细胞微环境的物质结构基础，也体现了细胞培养的直观性和条件可控性。这些优势导致了3D细胞培养的快速发展及其在组织工程、生物制药加工、毒性测试等各个领域的广泛应用[10-16]。目前，3D细胞培养最大的局限在于，由于培养面积过大，营养供给不足，内部细胞在堆积过程中容易发生坏死，而这种细胞在体内的3D生长是正常的。因为有丰富的微血管和微循环。受这种现象的启发，已经为3D细胞培养构建了许多多孔材料或微通道[17-22]。然而，由于缺乏有效的营养转运通道，大多数多孔材料通常尺寸太小而无法防止细胞坏死[23-25]。此外，传统的多孔材料无法有效模拟生物体内血管复合物的3D结构。因此，仍期待开发具有更复杂结构的新型多孔材料，以实现3D细胞培养。
在这项研究中，作者提出了一种新颖的分层反蛋白石多孔支架，该支架具有使用简单的液滴微流体方法制造的细胞培养所需的特征，如图1所示。反蛋白石支架由于其可控的孔径和均匀孔隙，模板由紧密堆积的单分散微球或液滴晶格组成[26-29]巧合的是，由于其出色的流动控制能力，微流体能够形成用于不同应用的高度单分散乳液，例如模板用于反蛋白石支架的微球或液滴晶格[30-36]。基于其3D结构特征，反蛋白石支架已广泛应用于光学材料、生物传感器、细胞支架、等等[37-39]。然而，由于其简单的空隙填充结构和支架的单一组成，目前关于使用反蛋白石支架进行3D血管化的研究仍然很少。
图1.(a)分层反蛋白石多孔支架的制造和(b)3D细胞共培养的示意图。GelMA：甲基丙烯酸明胶；PEO：聚（环氧乙烷）；HUVECs：人脐静脉内皮细胞；HepG2：人肝癌。
因此，通过乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的组合概念，我们在此构建了用于实现3D血管整合的分层反蛋白石支架。在本文中，我们证明了所得支架在细胞培养过程中保证了足够的营养供应，从而实现了大体积细胞培养。此外，通过在支架中连续种植不同的细胞，可以开发出内皮细胞包裹的肝细胞的3D共培养系统，用于构建某些功能性组织。这种共培养系统促进了更高水平的白蛋白和细胞色素P450(CYP450)的分泌，这表明支架中的共培养系统有助于维持肝细胞的活性和功能。
【文章的亮点结果分析】
在一个典型的实验中，由微流体产生的水包油(O/W)单乳液液滴被用作制造分层反蛋白石支架的模板，如图1所示。GelMA和PEO的混合物是被选为分层反蛋白石支架的骨架材料。GelMA是一种生物相容性水凝胶，在3D细胞培养和组织工程领域具有广泛的应用[40-43]。同样，由于其生物相容性、惰性和易于修饰，PEO通常用作制备水凝胶支架的致孔剂[44,45]。基于这些背景，我们通过在微流控装置中使用GelMA和PEO的混合物，然后去除PEO组分，从而制成分级多孔结构，制备了分级反蛋白石支架。
在我们的实验中，通过将玻璃管同轴组装在单个载玻片上来制造玻璃微流体装置。内毛细管用于引入分散相（例如甲基硅油），外毛细管用于引入连续相（例如GelMA和PEO溶液的混合物），最外面的方形毛细管用于记录液滴的在线生成过程。如图2（a）所示，甲基硅油在内管出口处被GelMA/PEO溶液乳化成液滴。可以通过调节两相溶液的流速来控制产生的液滴尺寸和支架的相应孔径。发现随着分散相速率的增加，液滴的直径明显增加。
图2.通过微流体技术生成的液滴模板。(a)内相不同流速的液滴在线生成图像（比例尺：500μm）。(b)液滴直径和流速之间的关系(n=3)(F1:外相流速,黑色方块;F2:内相流速,红色三角形)。(c)自组装液滴模板（比例尺：200μm）。(d)液滴的尺寸分布（变异系数为4.35%）。
如图所示。如图2（c）和（d）所示，生成的液滴尺寸均匀，球形度好，单分散性高，是反蛋白石支架的理想模板。在液滴组装成六边形密排排列后，GelMA预凝胶溶液随后聚合，最终通过洗去油产生分层反蛋白石支架的第一个分层结构（即均质大孔结构）n相-己烷和乙醇。使用光学显微镜和SEM观察所得GelMA/PEO支架，如图3所示。观察到GelMA/PEO支架具有均匀且相互连接的大孔结构（图3（a））。此外，相邻的孔通过多个统一的窗口相互连接，这有利于长期细胞培养，因为它可以增强营养物质或废物通过整个支架结构的运输（图3（b））。
在通过上述方法获得反蛋白石支架的第一级结构后，将生成的GelMA/PEO支架在PBS中浸泡48小时以上，从固化的GelMA水凝胶中去除PEO，形成第二级结构。为了观察PEO在水凝胶中的渗出，通过将PEO分子与FITC分子结合来进行PEO浸出试验。结果发现，随着时间的推移，PEO逐渐渗出，48小时后吸光度变化趋于平缓（附录A中的图S1）。通过SEM和CLSM的3D重建观察所得的多孔微观结构。结果表明，PEO渗出后产生了二级微孔结构（图3（c）和（d））。
图3分层反蛋白石多孔支架的结构。(a)支架的第一个层次结构的光学显微镜照片。(b)支架的第一个层次结构的SEM图像。(c)GelMA/PEO水凝胶的第二层次结构的3D重建荧光图像。(d)GelMA/PEO水凝胶的第二层次结构的SEM图像。(a)-(d)部分中的比例尺分别为200、200、100和10μm。
【文章的结论以及思考】
作者提出了一种分层反蛋白石支架，用于通过简单的微流体方法促进3D细胞培养。支架是乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的复合概念构建的。结果表明，所设计的支架保证了细胞增殖过程中营养物质的充足供应，从而实现了大体积细胞培养。此外，通过在支架中连续接种不同的细胞，开发了一种新型的内皮细胞包裹肝细胞3D共培养系统，用于构建某些功能性组织。这种共培养系统促进了更高水平的白蛋白和CYP450的分泌，这表明支架中的共培养系统可以帮助维持肝细胞的活性和功能。
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