胃癌(GC)是一个相当大的全球卫生负担;高级GC患者的中位生存期小于1年肿瘤干细胞(Cancerstemcells，CSCs)是肿瘤治疗失败的主要原因，其中包括GC2，但是目前对CSCs干细胞维持干细胞功能的机制仍然知之甚少。
KDM4C，也称为JMJD2C/GASC1，是Jumonjidomain-2家族组蛋白去甲基化酶的成员，该蛋白最初被认为是一种癌基因，在KYSE-150食管癌细胞系中被扩增在几种类型的癌症中，KDM4C的失调与肿瘤发生密切相关;基因表达的表观遗传调控是主要机制KDM4C在胚胎干细胞和肿瘤干细胞中也发挥着重要作用。3,4KDM4C抑制剂，如SD70，已被开发用于抗癌治疗。我们的结果从免疫组织化学的临床样本研究证实了这一点(图。1a及附图。S1a).然而，在低分化的GC组织中，KDM4C的表达明显上调(图。1a)，并与GCSCs标记正相关(图2。1b及补充图。第1b条)。此外，高表达的KDM4C预示低分化GC患者预后不良(图)。表明KDM4C在肿瘤干细胞中具有潜在的作用。另一方面，aldehyde活性升高是原始神经干细胞的重要特征之一;ALDH家族成员已被认为是各种实体肿瘤的CSCs标志物，并通过代谢信号(如ALDH-依赖的维甲酸(RA)信号)发挥重要作用因此，阐明ALDH家族成员的上游调控机制对于制定针对肿瘤干细胞的治疗策略具有重要意义。通过蛋白质组学研究、途径分析和Q-PCR(quantitativereal-timePCR)验证，我们发现ALDH1A3在高表达kdm4c的GC细胞中被上调。S2及Fig。3)，表明KDM4C和ALDH1A3之间的潜在联系。鉴于KDM4C和ALDH1A3的重要作用和我们以前的观察，我们在本研究中探讨了KDM4C和ALDH1A3对原代培养的神经干细胞的作用及其作为治疗靶点的可能性。
图。1
为了证实KDM4C的作用，我们用Q-PCR方法检测了KDM4C在GCSCs中的表达水平。与贴壁培养、CD44-和ALDH-细胞相比，悬浮培养的球状细胞、CD44+细胞和ALDH+细胞中的KDM4C明显增高(图2)。S4a).KDM4C过量表达(补充图。S4b)提高了细胞系和原代GC细胞的干性，表现为串联成球能力的增强。1d)、CD44、CD133、SOX2、OCT4等肿瘤标志物的表达(补充图。S4c)、ALDH活性(图。S4c)、成球细胞和肿瘤起始细胞的频率(图。1e)，以及多代致瘤性(补充图。S4d).KDM4C基因敲除或KDM4C抑制剂处理均能显著抑制GC细胞的干性，包括系列成球能力、标记物表达、ALDH活性和成球细胞频率(补充图。S5a-g).这些结果表明，KDM4C促进了GC细胞的干细胞化。
接下来我们研究了ALDH1A3在肿瘤干细胞中的作用。获得了类似的结果;ALDH1A3在中低分化的GC组织中异常上调(补充图。S6a)，与GCSCs标记正相关(补充图。S6b)，并预测预后不良(补充图。S6c).ALDH1A3的异位表达增加了系列成球能力、GCSCs标志物的表达、ALDH活性、成球和启动肿瘤细胞的频率以及多代肿瘤生成能力。S6d-h)在气相色谱(GC)细胞中的表达。ALDH1A3基因敲除和ALDH1A3抑制剂CM10处理，抑制系列成球能力、GCSCs标志物表达和ALDH活性(补充图。S7a-e).这些结果表明ALDH1A3对GC干性有正向调节作用。
由于KDM4C是一个组蛋白去甲基化酶，3,4我们检测了KDM4C诱导的组蛋白去甲基化是否参与了GC干性和ALDH1A3转录的调节。在低分化的GC组织中，发现KDM4C与ALDH1A3之间存在正相关关系。S8a).通过Q-PCR、荧光素酶报告试验、核苷酸运转试验和荧光素酶报告试验，证明KDM4C对ALDH1A3的转录具有正向调控作用。结果表明，KDM4C对ALDH1A3蛋白的稳定性没有明显的影响。S8d).结果表明，在ALDH1A3基因启动子上，KDM4C直接与ALDH1A3基因启动子结合，对H3K9me2和H3K9me3基因表达产生负调控作用。1f).只有野生型抗shRNA突变体KMD4C(H190A和E912A)和去甲基化酶死亡突变体KMD4C(H190A和E912A)能够恢复aldh1a3mrna水平(图2。1g)及茎状物质(补充图。结果表明，kdm4c击倒细胞中S8e-g蛋白的表达明显高于kdm4c击倒细胞。此外，缺乏ALDH1A3或ALDH1A3抑制剂处理显著消除了KDM4C对GC细胞系列成球能力、GCSCs标志物表达和ALDH活性的影响(图2)。1h，i及补充图。S9).这些结果表明，KDM4C通过组蛋白去甲基化激活ALDH1A3转录，这一过程对于KDM4C诱导的GC干性维持至关重要。
我们接下来发现，激活的ALDH1A3反过来激活KDM4C。同样，ALDH1A3上调了KDM4C的转录水平(图。1j及补充图。S10a)，ALDH1A3对KDM4C的稳定性没有影响(补充图。第10b条)。ALDH1A3与KDM4C启动子之间不存在直接结合。第10c条)。ALDH1A3产物全反式维甲酸(ATRA)，一种具有转录调控特性的核受体，治疗后也获得了相似的增加转录的KDM4C(补充图。S10d)，消融PU可消除这一效应(一个ATRA受体)(图。1k及辅助图。S10e，f).此外，KDM4C缺失或KDM4C抑制剂处理显著地消除了ALDH1A3对GC干性的影响(补充图。S11).这些结果表明ALDH1A3通过RA信号转导激活KDM4C以支持GC干性，并揭示了一个重要的前馈机制，即KDM4C-ALDH1A3环，用于维持GC干性。
接下来我们研究了KDM4C-ALDH1A3环是否可以作为根除GCSCs的药物靶点。结果发现，KDM4C和ALDH1A3的消融均能减少球源性GC细胞形成的肿瘤体积和肿瘤细胞中GCSCs标志物的表达，同时消融可导致小鼠的协同效应。1l及附图。S12a，b).使用抑制剂进行处理也得到了类似的结果(补充图。S12c).由于肿瘤干细胞对化疗药物具有耐药性，我们进一步研究了KDM4C和ALDH1A3抑制剂的增敏作用。在体外培养条件下，证实了球源性GC细胞的耐药性(补充图。KDM4C和ALDH1A3的过表达产生了类似的抗性(补充图。第13b条)。正如预期的那样，KDM4C和ALDH1A3的击倒和抑制剂的处理在体外对5-FU和顺铂敏感(补充图。S13c)和体内(图。1m和附加图s13d)，同时抑制产生协同效应(补充图。13c，1m，和S13d)。此外，KDM4C和ALDH1A3基因的敲除延长了荷瘤小鼠的存活时间。第13e条)。
总之，本研究揭示了一个重要的前馈机制，即KDM4C-ALDH1A3环，用于维持胃癌细胞的干性，这将成为根除人类胃癌细胞的一个新的治疗靶点。
